Tüm gram negatif bakteriler, mikroskopta genellikle pembe renkli küçük çubuklar şeklinde görünürler.
Gram negatif bakterilerin tür tespitinde başvurulabilecek 5 yol vardır:
1. Karbonhidrat fermentasyon testi
2. SIM Test (Hidrojen-Sülfit, İndol, Motility (Hareket))
3. Sitrat testi
4. Phenylalanine Deaminase (PA)Testi
5. Ürease Testi
Gram negatif bakteriler genellikle, Mac Conkey Agar’da kültüve edilirler. Bu besiyeri, gram-pozitif bakterileri inhibe etmek amacıyla safra tuzları ve kristal viole içermektedir. Yine agarın içindeki laktoz ve nötral red boyası, pH değişikliğini gösterir. Laktoz pozitif koloniler, kırmızı-pembe görünür.
Karbonhidrat Fermentasyon Testi:
· Genellikle pH indikatörü olarak fenol red içeren bir brot ile yapılır.
· Bu brotlar Phenol Red Broth veya Lactose Red Broth olabilir.
· Mikrorganizmanın karbonhidratı fermente etmesi sırasında oluşan gaz çıkışını gözlemleyebilmek için, test tüplerinin içine Durham tüpleri de konulmuş olmalı.
· Mikroorganizmanın laktozu glukoza ve galaktoza çevirebilmesi için beta-galaktosidaz içermesi gereklidir.
· Organizma basit şekerleri fermente ettiğinde, asidik son ürünler ortaya çıkar. Bunlar daha düşük pH değerlerindedirler ve brotun rengini sarıya değiştirirler.
· Test sonucunda:
1. Negatif : Kırmızı brot – fermentasyon yok
2. A/G Pozitif: Asit ve Durham tüplerinde gaz çıkışı var ve brotun rengi sarıya dönmüş
3. Asit pozitif: Besiyerinin rengi sarıya dönmüş; fakat gaz çıkışı yok.
SIM Testi:
· Öze ile alınan kültür SIM Agar’a direkt batırma yoluyla inokule edilir.
· SIM Medium, aminoasitleri metabolize edebilen mikroorganizmaların tespitinde kullanılır.
· SIM medium ile 3 ayrı test yapılır
o Hidrojen Sülfit (H₂S)
- Cystamin ve Metathiamine sülfür içerir. Organizma bunları metabolize edebilirse, hidrojen oluşumu gerçekleşir.§ Agardaki kurşun nitrat hidrojen sülfiti tutar, kurşun sülfit oluşumuna bağlı olarak siyah bir çökelme meydana gelir. Hidrojen sülfit pozitif durumlarda agar, siyah renk alır.
- Negatif durumda, besiyeri renginde değişiklik olmaz.
o İndol
- Aromatik aminoasit triptofan, besiyeri içerisinde bulunmaktadır. Bakteri bu amino grup molekülünü ve indolü kırabilirse, test pozitif sonuç verir.
- Bakteri gelişmesini tamamladıktan sonra, Kovac’s ayıracı indol ile reaksiyona girecek ve tüp yüzeyinde parlak kırmızı bir halka oluşturacaktır.
- Test negatif ise, kovac’s ayıracı eklendiğinde renkte bir değişiklik olmaz.
o Motility (Hareket)
- Organizma hareketliyse, ekim hattının dışına taşar ve mediumda bulanıklık oluşturur.
- Eğer hareket negatifse, üreme, ekimin yapıldığı hat üzerinde kalır.